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Bei der Pyrosequenzierung analysieren wir Ihre DNA-Sequenzen mittels aktuellen Qiagen ID- und Q24-Instrumenten.

 

Pyrosequenzierung ist eine der zuverlässigsten Methoden, um einen DNA-Einzelstrang durch die Synthese seines Komplementärstrangs zu sequenzieren. Nach Komplementierung jeder einzelnen ungepaarten Base des Hauptstrangs mit dem passenden Nukleotid wird eine Enzymkaskade aktiviert, die zu Chemolumineszenz führt. Dies resultiert in einem online detektierbaren und quantifizierbaren Lichtsignal (siehe Abb. 1). Aufgezeichnete Lichtsignale liefern Informationen über die DNA-Sequenz und ihren Methylierungsgrad.

  

Pyrosequenzierung Schritt für Schritt:

 

Schritt 1:

Die zu untersuchende DNA wird extrahiert und mit Bisulfit behandelt, um unmethylierte Cytosine in Uracile zu verwandeln. Nach Amplifikation der DNA mittels PCR, durch die alle Uracile durch Thymidine ersetzt werden, wird die Probe denaturiert um einzelsträngige DNA (ssDNA) zu erhalten. Sobald ein Sequenzierprimer an die einzelsträngige DNA gebunden wurde, wird der Komplementärstrang in Gegenwart von Adenosin-5’-Phosphosulfat (APS), Luziferin und den Enzymen DNA-Polymerase, ATP-Sulfurylase, Luziferase und Apyrase gebildet.

 

Schritt 2:

Die Pyrosequenzierung wird durch Zugabe eines der vier Desoxynukleotid-Triphosphate (dNTPs) gestartet. Wenn dieses komplementär zur ersten ungepaarten Base des Hauptstranges ist, katalysiert die DNA-Polymerase seinen Einbau in den entstehenden Strang, wobei Pyrophosphat (PPi) freigesetzt wird. Dessen Menge entspricht der Anzahl eingebauter Nukleotide.

 

Schritt 3:

Freigesetztes PPi wird durch die ATP-Sulfurylase, die APS als Substrat verwendet, zu ATP umgesetzt, welches wiederum die Luziferase-Reaktion antreibt. Dadurch wird Luziferin in Oxyluziferin verwandelt. Dies resultiert wiederum in einem sichtbaren Lichtsignal – dessen Stärke proportional zum verbrauchten ATP ist und mit einer Kamera erfasst werden kann. Mehrere Peaks, die durch den Einbau sukzessiven Einbau mehrerer Nukleotide entstehen, ergeben das Pyrogramm (siehe Abb. 2).

 

Schritt 4:

Apyrase, ein Enyzm das Nukleotide degradiert, baut nicht eingebautes ATP und dNTP kontinuierlich ab. So wird das Licht wieder „ausgeschaltet“ und die Reaktionslösung regeneriert. Die Schritte 2 und 3 können nun mit dem nächsten dNTP begonnen werden.

 

Schritt 5:

Die Zugabe der dNTPs erfolgt einzeln. Desoxyadenosin-alpha-thio-triphosphat (dATPas) wird hierbei als Ersatz für das Desoxyadenosin-triphosphat verwendet, da es von der DNA-Polymerase sehr effizient, von der Luziferase jedoch nicht als Substrat erkannt wird. Der Komplementärstrang wird durch Voranschreiten des Pyrosequenzierungs-Prozesses gebildet. Die Nukleotid-Sequenz kann an den Signal-Peaks aus dem Pyrogramm abgelesen werden.

 

Methylierungsanalysen mittels Pyrosequenzierung liefern erstklassige Ergebnisse, wenn wie bei varionostic entsprechende umfangreiche Erfahrungen im Assay Design und in der Methodenanwendung vorliegen. Zu den Vorteilen zählen:

 

  • Pyrosequenzieren bietet große Flexibilität beim „Setzen“ der Primer. Dadurch ist es einfach, für nahezu jeden genetischen Marker einen Pyrosequenzierungs-Assay zu planen.
  • Pyrosequenzier-Ansätze sind mutations-tolerant. Im Gegensatz zu Ansätzen die auf Hybridisierung basieren, generiert Pyrosequenzieren die richtige Sequenz, auch wenn eine neue, unerwartete Mutation auftritt.
  • Die mittels Pyorsequenzieren erzielten Daten sind immer quantitativ.
Abb. 1.: Die Funktionsweise des Pryosequenzierens.
Abb. 2: Pyrogramm einer Pyrosequenzierungs-Reaktion mit 7 eingebauten Nukleotiden. Doppelte Signalhöhe bedeutet den aufeinanderfolgenden Einbau von 2 gleichen Nukleotiden.